抗体介导的非洲猪瘟病毒中和反应：误区与事实

用传统的蚀斑减少中和试验测量被抗体中和的ASFV存在许多难点，因为许多毒株，尤其是低代次毒株，会出现蚀斑缺失或延迟形成的现象。在病毒自然宿主细胞猪巨噬细胞中进行中和试验时，会遇到更多的问题。因此大多数作者采用高度适应细胞系的毒株进行中和试验，下一章将对这点进行深入讨论，因为这对结果有重要的影响。为了克服这个问题，研究者开发了表达显色标记基因如β-葡萄糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶的基因修饰病毒(Gómez-Puertas et al., 1995)，用于对ASFV抗体中和机制的深入研究。无论这些在细胞培养中是低代次还是非传代，都可以用于中和试验，且实验用时不到非修饰病毒的三分之一;通过颜色对比可以更准确地检测小蚀斑;可用于比较病毒在原代细胞和细胞系上的不同中和效果。

上述表达标记基因的重组病毒已被用于一系列关于感染减毒病毒的康复猪体内是否存在中和抗体的研究中(Gómez-Puertas et al., 1996)。这些猪的高温灭活血清降低了几种细胞培养低代次病毒87-100%的感染性。如前所述，部分病毒(4-13%)存在非中和现象(Ruiz Gonzalvo et al., 1986a;Zsak et al., 1993)，在其它囊膜病毒中也发现了这种现象(Ashe and Notkins, 1967;Jackson et al., 1991;Poumbourios et al., 1990)。中和抗体的诱导产生可能出现在减毒病毒感染早期，在大多数情况下，感染后9天的康复猪血清可以中和病毒50%以上的感染性。免疫猪的中和抗体在感染后的第二周周末到达平台期(Gómez-Puertas et al., 1996)。

减毒疫苗免疫猪体内的抗体至少使用两种机制中和病毒在细胞系和巨噬细胞原代培养中的感染性。病毒与Vero细胞或猪肺泡巨噬细胞的结合存在饱和机制(Alcami et al., 1989)，反应开始后120-240分钟达到平台期(Gómez-Puertas et al., 1996)。4℃(病毒内化被抑制)条件下，在病毒吸附细胞前后添加抗体，可以探究抗体对病毒吸附的阻断作用(图2A)。病毒与易感细胞的结合抑制与病毒中和有相关性。用放射性元素标记的病毒进行实验，无论是在Vero细胞还是在巨噬细胞中，当无中和抗体对照组细胞结合病毒量达到最大时，ASFV免疫血清组的细胞结合病毒量较对照组减少80%以上(Gómez-Puertas et al., 1996)。平行中和实验表明，免疫血清降低了病毒90%以上的感染性。说明ASFV中和机制的其中一条是抗体抑制病毒与细胞的结合。

另一条ASFV中和机制通过用免疫血清抑制病毒内化(图2B)的实验得以证明。在4℃让病毒吸附细胞后，分别添加对照血清和中和血清孵育，去除血清后，培养温度恢复到37℃让病毒在无血清条件下内化4h，最后用蛋白酶处理得到未内化病毒粒子。对照组病毒内化未受影响，而添加中和血清的实验组，90%以上的病毒从细胞表面脱落下来(Gomez-Puertas et al ., 1996)。用Vero细胞与猪巨噬细胞进行上述实验，结果无显著差异。这些观察揭示了第二种ASFV中和机制，该机制破坏了病毒复制周期第二步中涉及病毒内化的过程。

图2 ASFV中和机制的确定。(A)放射标记ASFV的细胞吸附经对照血清和免疫血清孵育后的抑制百分比。(B)内化抑制实验中经蛋白酶K处理后脱离Vero细胞的病毒百分比。

用ASFV进行的实验不能像其他病毒模型那样(Sune et al., 1990)，可以分辨在不同抗体-病毒比例下可能占主导的机制。然而，在本病毒模型的条件下，这两种机制的效率几近相同。约80%的病毒与细胞的结合被抑制，超过90%的病毒在中和抗体存在的情况下无法内化(Gomez-Puertas et al., 1996)。这两种机制的组合可以抑制了95%以上的病毒感染。总之，ASFV的中和作用可能源于病毒复制周期受到抑制，抑制作用至少发生在两个步骤，分别为病毒吸附和内化。

4. 影响 ASFV 中和反应敏感性的因素

过去，研究者认为ASFV不能被抗体中和(Hess, 1981;Vi nuela, 1985)。有趣的是，Zsak et al .(1993)的一项研究表明，感染ASFV E75株的康复猪血清可以中和Vero细胞和巨噬细胞培养的多个高毒力ASFV毒株(E75、E70、Lisbon 60、Malawi Lil 20/1)和适应组织培养的低代次毒株86-97%的感染性，但未能中和适应组织培养高代次毒株(Lisbon 60、Haiti、Dominican Republic I、Dominican Republic II和Brazil II)。用可以与所有病毒反应的单克隆中和抗体(135D4)进行的实验也得到了类似的结果。据此，作者提出，ASFV毒株的组织适应性与病毒中和相关特质的丢失有关。

ASFV在细胞系中的增殖会改变病毒遗传和表型的一些关键特性，例如在自然宿主细胞猪巨噬细胞中的复制能力(Alcaraz et al., 1992;Rodriguez et al., 1994)。但不是所有在细胞系中增殖的病毒都会出现中和相关抗原构象的巨大改变。后来的一项研究(Gómez-Puertas et al., 1997)证实，低代次病毒和高代次病毒对中和的敏感性不同(图3A)。作者证明，敏感性的差异并不是因为关键表位的抗原变异，并揭示了敏感性与ASFV病毒粒子磷脂成分的相关性;随着病毒在细胞培养中代次的增加，磷脂成分发生了变化。对低代次病毒和高代次病毒细胞膜磷脂成分的比较分析发现，这两组病毒的磷脂酰肌醇相对含量存在差异，且这种差异与用于病毒培养的细胞无关(图3B)。通过Percoll密度梯度离心沉降法进一步纯化低代次病毒和高代次病毒，发现其磷脂组成与之前的结果一致，并验证了病毒对中和的敏感性。向高代次病毒的囊膜插入磷脂中的主要成分磷脂酰肌醇使其具有类似低传代病毒的中和敏感性(图3C)，其他磷脂成分则不影响高代次病毒的中和，这表明磷脂酰肌醇对于抗原表位向中和抗体的正确展示至关重要。此外，用特异性脂肪酶去除低代次病毒囊膜中磷脂酰肌醇会使低代次病毒由可中和变为不可中和(图3C)。这些数据揭示了病毒膜脂质组成对抗体识别蛋白质的重要性，并可能在一定程度上解释了为什么过去ASFV高代次病毒与中和抗体的实验难以重现。

考虑到高代次和低代次病毒中和效果的差异，应谨慎选择用于中和研究的病毒毒株。目前已证实了其他依赖于病毒代次和/或宿主系统的中和案例(Baldinotti et al., 1994;Grady and Kinch, 1985;Kim et al., 1994)。与其他病毒系统一样(Luan et al., 1995)，ASFV可以主导其膜磷脂的组成，因为在同一细胞中培养的低代次和高代次病毒的膜中磷脂的相对比例不同(Gómez-Puertas et al., 1997)。在水貂阿留申病毒中，病毒粒子的脂质组成决定了它们能否被中和(Stolze and Kaaden, 1987)。低代次病毒粒子中存在大量磷脂酰肌醇，说明ASFV的囊膜来源于宿主细胞内质网(ER)，新形成的病毒粒子的磷脂组成类似于已知的ER膜组成，且基本上所有磷脂酰肌醇都是在ER中合成的(van Meer, 1989)。与之相反，不可中和的高代次病毒粒子的磷脂组成介于ER膜和之后的分泌部件膜之间(van Meer, 1989)。表明低代次病毒和高代次病毒的膜形成机制不同(Sodeik et al., 1993)。

图3 ASF病毒粒子磷脂成分与抗体中和敏感性的相关性。(A)用康复猪血清在Vero细胞上进行噬斑减少试验检测细胞系培养低代次病毒和高代次病毒的中和敏感性。(B)纯化低代次病毒和高代次病毒囊膜磷脂组成，用磷脂酰肌醇的相对含量表示。(C)低代次病毒和高代次病毒经添加(+)或去除(—)磷脂酰肌醇后的中和敏感性。

磷脂对乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的抗原特性起着至关重要的作用。该蛋白经一组单克隆抗体鉴定得到的所有表位在与酸性磷脂重构后表现出不同反应活性(Gomez-Gutierrez et al., 1994, 1995)。HBsAg蛋白与酸性磷脂之间的静电相互作用是抗原活性完全恢复的部分原因。作者提出抗原活性依赖于磷脂分子的物理状态。抗原在细胞膜上形成构象后，各种磷脂与抗原的额外相互作用可能改变抗原性，如HBsAg(Gómez-Gutierrez et al., 1994, 1995)或ASFV中参与中和的表位所示。

未完待续……